熒光定量PCR儀引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。
　　要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
　　現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。一般引物長(zhǎng)度為15~30堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100~600堿基對(duì)。
　　讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
　　同時(shí)熒光定量PCR儀引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。
　　引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3′端不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。
　　綜上所述可歸納十條熒光定量PCR儀引物的設(shè)計(jì)原則：
　　1.引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。
　　2.產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　3.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。
　　4.G+C含量在40%~60%之間。
　　5.堿基要隨機(jī)分布。
　　6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
　　7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
　　8.引物5′端可以修飾。
　　9.引物3′端不可修飾。
　　10.引物3′端要避開密碼子的第3位。