熒光定量PCR儀相關(guān)對照問題的處理
1.陰性對照和陽性對照都出現(xiàn)陽性擴(kuò)增帶
原因:
①陰性樣品和PCR反應(yīng)試驗(yàn)污染。
②電泳上樣時(shí)避免PCR產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定。
解決方法:
①更換全部試劑,必要時(shí)更換所有移液器。
②應(yīng)小心操作,或瓊脂糖凝膠加厚,增加每孔的容量,可避免加樣液的溢出。
2.陽性對照呈陰性
原因:
①陽性樣品或加入陽性模板失效。無論是組織還是血清,凍融1次后病原數(shù)量明顯減少。
②加入試劑量不準(zhǔn)確或遺忘了某一成分。
解決方法:
①將陽性對照樣品分成小包裝。每個(gè)包裝夠用1次好。
②仔細(xì)核對試驗(yàn)記錄,校對移液器。
3.出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶
原因:
①樣品模板量過多。
②引物或TaqDNA聚合酶多。
③鎂離子濃度過高或退火溫度過低。
解決方法:
依據(jù)熒光定量PCR儀具體實(shí)驗(yàn)的情況,分析上述可能出現(xiàn)的原因,采取相應(yīng)的措施。
4.陽性對照擴(kuò)增帶弱
原因:
①電泳時(shí)瓊脂糖中EB含量少或長時(shí)間后再用已失效。
②擴(kuò)增效率不高。
解決方法:
①是將瓊脂糖凝膠放入含有EB電泳液中再染30 min后再觀察。
②檢測儀器是否正常工作。
③增加純化DNA或cDNA樣品的稀釋倍數(shù)。