雖然熒光探針（引物）不斷有新的技術(shù)出現(xiàn)，但是作為一種經(jīng)典的
定量PCR儀技術(shù)，探針技術(shù)仍然是許多實驗研究人員進行定量檢測的，這主要是因為相對于熒光染料，探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補區(qū)，而且熒光信號與擴增的拷貝數(shù)具有對應(yīng)的關(guān)系，因此特異性強靈敏度高，而且條件優(yōu)化容易；而相對于雜交探針，探針只要設(shè)計一條探針，因此探針設(shè)計較便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR儀要求。當(dāng)然定量方法由于還是要合成探針，也給實驗操作帶來了挑戰(zhàn)。
一般定量PCR儀實驗過程為：目的基因查找比對→探針與引物設(shè)計→探針與引物合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實驗，優(yōu)化條件→獲得曲線數(shù)據(jù)，比對標(biāo)準(zhǔn)曲線→再重復(fù)驗證。
總體原則：
先選擇好探針，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近探針。
所選序列應(yīng)該高度特異，盡量選擇具有小二級結(jié)構(gòu)的擴增片段—這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進行二級結(jié)構(gòu)檢測，如果不能避免二級結(jié)構(gòu)，那么就要相應(yīng)提高退火溫度。
為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）。
將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
探針位置盡可能地靠近上游引物。
定量PCR儀檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)。
整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量—G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針。
為確保引物探針的特異性，好將設(shè)計好的序列再核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。
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